熒光原位雜交技術（Fluorescence in situ hybridization，FISH）是一種應用非放射性熒光物質依靠核酸探針雜交原理在核中或染色體上顯示核酸序列位置的方法。該技術問世與70年代中期左右，其曾多于與染色體異常的研究，近年來隨著FISH探針種類的不斷增多，使得該技術逐步應用于各種領域。

該技術具有快速，安全，靈敏度高以及探針可長期保存等特點，目前已廣泛應用于細胞遺傳學，腫瘤生物學，基因定位，基因作圖，基因擴增及分子診斷等領域。

1、對于FISH操作來說，那些因素比較重要？

在FISH中Z重要的因素是溫度、光照、濕度和各種試劑的PH值。溫度和濕度直接影響著探針和目標DNA的雜交效率；光照影響了熒光染料的強度，因此探針要避光保存，其已經雜交的片子可用防熒光淬滅劑封片且避光保存；各種試劑pH也要精確達到要求，這也直接關系到FISH的穩定性。

2、如何保證FISH操作中的溫度？

Z佳的措施是使用一些FISH的專用儀器進行操作，如Vysis的Hybrit FISH雜交儀。如果是手工操作，首先要對FISH操作過程中可能使用的一些儀器進行溫控能力的檢查，如水浴鍋、孵箱，對其中不符合要求的要進行更換（疾病診斷中的探針要求溫控精度在0.5度以內）。

其次，要盡可能地保持操作環境溫度在20度以上，對于在冬季進行的FISH操作尤為重要。此外對于需要預熱以達到要求溫度的試劑，在使用前要使用溫度計對其進行測溫。同時檢測的樣本Z好不能超過4塊。操作中的行動一定要迅速。操作者還往往忽視一些小部件的溫度，諸如載玻片和蓋玻片。

特別是在冬季，蓋玻片本身溫度就低，加之探針的量本就不多（10ul），因此事先沒有預熱的蓋玻片會使得雜交液的溫度急劇下降嚴重地影響了探針和目標DNA的雜交效率。因此對上述小部件的要進行預熱處理，不然會影響FISH的雜交效果。

3、使用熒光顯微鏡觀察結果時，Z初有清晰而明亮的信號，但隨后信號急劇衰減，幾分鐘后信號就消失了。這是探針本身的質量問題嗎？

正常情況下，商業化探針即使是雜交后，如保存適當，熒光信號能保持半年以上。出現上述情況主要的原因是操作觀察的過程中或是探針的保存過程中沒有采取嚴格的避光措施。

陽光或是強的燈光都會使熒光染料發生急劇的淬滅，從而造成了觀察結果的不穩定。因此在操作和觀察時，盡可能在暗室中操作，也可以在封片觀察時加入一定的antifade（抗淬滅劑）以延緩熒光素的淬滅。

4、如何配制各種試劑呢？

強烈建議使用滅菌去離子水配制各種所需的試劑。此外，配制后使用pH計檢測是否符合要求。配制的各種試劑都要采用超純級要求。每次FISH使用新的試劑，舊的試劑Z好棄置不用。洗脫液和變性液當天用當天配。

5、直標型探針和間標型探針有何不同？

為什么我們要選擇直標型探針？所謂的直標型探針是指DNA探針共價連接熒光素基團；間標型探針則是指DNA探針先與某個半抗原連接，諸如生物素或地高辛，然后半抗原與熒光素基團連接從而形成探針－半抗原－熒光素基團，類似“三明治”的復合物。

與間標型探針相比，直標型探針具有低背景、高特異性的特點。隨著熒光染料和熒光檢測技術的不斷發展，直標型探針的靈敏度也不斷提高。因而在FISH檢測領域，尤其是在疾病分型領域，探針大多采用直標型設計。

6、能對同一樣本進行多次的FISH操作嗎？

在多數情況下，如果FISH操作沒有得到正常的結果，我們可以將探針洗去，然后使用同樣的探針進行再次的雜交。如果我們使用的是直標型探針，還可以使用不同探針對同一樣本進行反復雜交。針對不同的樣本，處理方法略有不同。

外周血樣本的處理：

1、使用鑷子小心地揭去雜交區的蓋玻片

2、將樣本片浸泡于70％、85％和100％的乙醇中各一分鐘以便充分地脫水。將片子風干后就可以進行重復的雜交了。二次雜交中建議將變性的時間縮短一半，但不得少于3分鐘。如果對同一樣本還要進行三次雜交，變性的時間就無需減少了。對于多次雜交，復染液濃度的降低有利于保持探針的亮度。

曾有報道在同一樣本片上進行了多達8次的FISH操作。也可對已經進行G帶顯色的樣本片進行FISH操作：將樣本片浸泡于70％、85％和100％的乙醇中各二分鐘以便充分地脫水。將片子風干后就可以進行重復的雜交了。

二次雜交中建議將變性的時間縮短一半，但不得少于3分鐘。如果對同一樣本還要進行三次雜交，變性的時間就無需減少了。

7、FISH技術有哪些主要優勢？

① 安全、快速、靈敏度高；

② 探針能較長時間保存；

③ 多色標記，簡單直觀；

④ 可用于中期染色體及間期細胞的分析；

⑤ 可應用于新鮮、冷凍或石蠟包埋標本以及穿刺物和脫落細胞等多種物質的檢測。

8、目前能開展原位雜交這方面工作是否相對可信的公司？

上海舜百生物可提供原位雜交技術服務項目，那邊公司在正式接受實驗委托三周內（客戶需要提供探針和檢測樣本）交付實驗結果，所提供實驗結果忠實于樣本的實際情況。如果有相關意向可以，與那邊取得聯系。目前主要集中在DNA水平方面檢測，而針對RNA這塊比較困難。

9、原位雜交技術的發展前景如何？

FISH 技術作為連接分子生物學與細胞生物學的橋梁地位已為世人所公認。

盡管目前FISH技術無法達到***完全雜交，特別是在應用較短cDNA探針時存在雜交效率明顯下降的問題，但隨著各種新型分子探針以及更為精密G端的光學顯微鏡和功能強大的計算機分析系統的不斷問世，上述問題將會逐步得到解決，該技術的作用正變得日益重要，應用領域也得以不斷擴展。FISH技術在泌尿系統腫瘤研究領域的巨大潛力與光明前景將**我們進入全新時代。

文章來源：體外診斷IVD知識庫公眾號   

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