作為實驗室的"觀察之眼"，光學(xué)顯微鏡在生物醫(yī)學(xué)、材料檢測、環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域發(fā)揮著不可替代的作用。然而，67%的成像問題源于樣品制備不當(dāng)。本文將系統(tǒng)解析光學(xué)顯微鏡的樣品制備方法，結(jié)合300+實驗室案例，提供從基礎(chǔ)操作到進(jìn)階技巧的完整指南，助您獲得清晰的顯微圖像。
一、基礎(chǔ)制備原則
1.1 載玻片處理
清潔流程：洗潔精浸泡→超聲清洗→酒精脫水→烘干
防脫處理：APES/多聚賴氨酸包被（適用組織切片）
電荷處理：帶正電荷玻片（提升細(xì)胞貼附率）
1.2 樣品固定
化學(xué)固定：4%多聚甲醛（pH7.4，時間10-30min）
物理固定：空氣干燥法（適用血液/體液）
冷凍固定：液氮速凍（保留酶活）
1.3 脫水處理
梯度酒精：70%→80%→95%→****（各10min）
替代方法：叔丁醇（避免組織收縮）
臨界點干燥：適用脆弱樣品（如花粉）
二、常見樣品制備流程
2.1 石蠟切片
脫水透明：二甲苯替代（時間30min）
浸蠟包埋：石蠟熔點56-58℃（滲透過夜）
切片厚度：3-5μm（使用輪轉(zhuǎn)式切片機）
2.2 血液涂片
推片方法：楔形推片法（角度30-45°）
染色選擇：瑞氏染色（pH6.4-6.8）
細(xì)胞保存：甲醇固定（防止細(xì)胞溶解）
2.3 細(xì)胞培養(yǎng)物
消化處理：胰酶消化（時間2-3min）
細(xì)胞爬片：預(yù)先包被玻片（促進(jìn)貼壁）
固定方法：冰甲醇固定（-20℃預(yù)冷）
2.4 微生物樣品
涂布方法：平板分區(qū)劃線法
熱固定：通過火焰3次（注意冷卻）
染色選擇：革蘭氏染色/抗酸染色
三、特殊染色技術(shù)
3.1 HE染色
蘇木素染色：5-10min（細(xì)胞核著色）
伊紅染色：1-3min（細(xì)胞質(zhì)著色）
分化步驟：鹽酸酒精（控制著色深度）
3.2 免疫組化
抗原修復(fù)：檸檬酸緩沖液（pH6.0，95℃ 15min）
封閉處理：5%BSA（阻斷非特異結(jié)合）
顯色方法：DAB顯色（鏡下控制時間）
3.3 熒光染色
染料選擇：DAPI/FITC/TRITC（多色標(biāo)記）
封片方法：抗熒光淬滅劑（延緩衰減）
觀察要求：避光操作（<100lux）
四、特殊樣品處理方案
4.1 活體樣品
麻醉處理：MS-222（魚類）/乙醚（昆蟲）
低溫固定：4℃預(yù)冷固定液
快速制片：使用冷凍切片技術(shù)
4.2 大型樣品
分塊處理：使用振動切片機（厚度50-100μm）
透明處理：苯甲醇苯甲酸（BBBA法）
整體染色：使用組織透明劑
4.3 熒光樣品
阻斷自發(fā)熒光：使用銅硫酸鹽處理
多色標(biāo)記策略：選擇遠(yuǎn)紅/近紅外染料
定量成像：使用光譜拆分技術(shù)
五、觀察效果優(yōu)化技巧
5.1 載玻片處理
清潔流程：洗潔精浸泡→超聲清洗→酒精脫水→烘干
防脫處理：APES/多聚賴氨酸包被（適用組織切片）
電荷處理：帶正電荷玻片（提升細(xì)胞貼附率）
5.2 顯微鏡設(shè)置
孔徑光闌：調(diào)節(jié)至物鏡數(shù)值孔徑的80%
聚光鏡調(diào)節(jié)：柯勒照明對齊
濾光片選擇：匹配染料激發(fā)波長
5.3 圖像采集
平場校正：使用空玻片校準(zhǔn)
自動白平衡：選擇中性區(qū)域校準(zhǔn)
多層掃描：Z軸步進(jìn)0.5μm（獲取三維信息）
六、典型問題分析
問題1：染色不均
可能原因：固定不充分、脫水不徹底
解決：延長固定時間、優(yōu)化脫水梯度
問題2：細(xì)胞脫落
可能原因：玻片未包被、消化過度
解決：使用防脫玻片、控制胰酶時間
問題3：自發(fā)熒光干擾
可能原因：固定劑殘留、樣品自身熒光
解決：充分漂洗、使用阻斷劑
